感受態(tài)細胞
感受態(tài)細胞(competent cell)是理化方法誘導細胞,即細胞處于能攝入核酸分子時的生理狀態(tài)。這種方法已經成為基因工程的常規(guī)技術,使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大,直觀的說,使得細胞膜表面出現一些孔洞,便于外源基因或載體進入感受態(tài)細胞。由于細胞膜的流動性,這種孔洞會被細胞自身所修復。它對于我們利用體外DNA重組技術來了解真核和原核生物的基因功能特別重要。
制作方法 編輯本段
CaCl2法
1.將快速生長的大腸桿菌置于經低溫(0℃)預處理的低滲氯化鈣溶液中,便會造成細胞膨脹,同時Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構,促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來,離開所在區(qū)域,誘導細胞成為感受態(tài)細胞
細胞膜通透性發(fā)生變化,極易與外源DNA相粘附并在細胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基-磷酸鈣復合物。
聯合其它的二價金屬離子(如Mn、Co)、DMSO或還原劑等物質處理細菌,則可使轉化率提高100~1000倍。
2.此時,將該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激(90s),細胞膜的液晶結構會發(fā)生劇烈擾動,并隨機出現許多間隙,外源DNA就可能被細胞吸收。進入細胞的外源DNA分子通過復制、表達,實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。
3.將轉化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng),篩選出帶有外源DNA分子的陽性克隆。
電轉法
電擊法不需要預先誘導細菌的感受態(tài),依靠短暫的電擊,促使DNA進入細菌,轉化率最高能達到109~1010轉化子/ug閉環(huán)DNA。因操作簡便,愈來愈為人們所接受。
表達意義 編輯本段
將構建好的載體轉入感受態(tài)細胞進行表達,不僅可以檢驗重組載體是否構建成功,最主要的是感受態(tài)細胞作為重組載體的宿主可以進行后續(xù)實驗,如蛋白質表達純化等工作。
種類劃分 編輯本段
細菌的轉化有兩種類型:一種是自然轉化(natural transformation),在自然轉化中細菌可以自由地吸收DNA,通過它來進行遺傳轉化;另一種是工程轉化(engineered transformation),在這種轉化中,細菌發(fā)生改變使得它們能攝入并轉化外源DNA。枯草桿菌中的轉化屬于自然轉化,E.coli轉化就屬于工程轉化。

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